大学生新闻 大学生活 校园文学 hthcom华体会
hth电竞官方下载 hth官方下载 hthvp华体会 hth358华体会 社会实践心得
全国排名 校友会版 hthcom华体会赌博 分类排名 本科排名 一本排名 hth359华体会 hth365华体会
求职简历 职场法则 面试技巧 职场故事 求职招聘
英语学习 计算机学习 电气工程 机械工程 经济管理 建筑设计 财务会计
申请书 证明书 检讨书 自荐信 演讲稿 心得体会 调查报告 读后感 求职信 推荐信 其它范文

对B吸附双模板蛋白质的吸附性能进行研究

分子印迹技术是制备空间结构和结合位点与模板分子完全匹配的聚合物的技术,通过模板分子与具有官能团的功能单体相互作用,在交联剂的存在下引发聚合,形成大孔、网状的聚合物,进而除去模板,在聚合物中形成与模板分子空间匹配的具有多重作用位点的印迹孔穴,得到分子印迹聚合物(MIP)。在大多数情况下,分子印迹聚合物的特异性识别位点是通过一种模板分子而产生的,然而分子印迹聚合物的制备过程却可以不局限于使用单一的模板分子,可以实现同时印迹多种组分。Sreenivasan 等制备了水杨酸和氢化可的松为模板分子的印迹聚合物,该聚合物对两种模板均呈现出选择性结合。不久,该研究小组又制备了具有类似效果的以胆固醇、睾酮和氢化可的松为模板的三重模板印迹聚合物。Dickert 等在制备两种模板同时印迹的交联聚氨酯薄膜时,提出了“双重分子印迹(double molecularimprinting)”的概念。多模板印迹的优点在于可以同时提取、分离、分析和检测同一样本中多种目标分析物,而单一印迹聚合物则主要对一种模板分子具有选择性识别能力。这些关于双/ 多模板印迹的报道主要集中在小分子印迹聚合物上,由于生物大分子蛋白质具有庞大的分子体积、复杂多变的构象及对环境非常敏感等特点,制成蛋白质印迹的难度较大,而制成双蛋白质印迹聚合物的难度就更大了,也更鲜有了。

  目前对蛋白质印迹多采用表面印迹法,在开发新的印迹方法如光接枝聚合法或引入新的印迹功能单体如丙烯酰基-β-环糊精时,文献中多使用溶菌酶(Lyz)做模板蛋白质。Lyz(13. 4 kDa,pI11. 2)的相对分子质量较小,它广泛存在蛋清、泪液、唾液及其他体液中,是肺结核、真菌脑膜炎等各种疾病诊断的重要指标。而牛血清白蛋白(BSA,66. 0 kDa,pI 4. 9)是牛血清中的主要成分,主要用于生化及医药研究,相对分子质量较大,对大蛋白质的印迹过程中,通常用到除氢键之外的蛋白质与单体间其他较强的相互作用[19],或直接将较大蛋白质共价接枝到载体基质表面来实现成功印迹。原子转移自由基聚合法(ATRP)是一种可控的自由基活性聚合反应,与传统的自由基聚合反应相比,ATRP 的反应条件温和,无需加热和紫外光照,室温下可在水介质中发生反应,能够避免不均匀反应等逆向反应和溶胶凝胶现象,适于蛋白质的分子印迹。本文在以往工作的基础上,采用ATRP法,以两种相对分子质量和等电点差异较大的蛋白质——BSA 和Lyz 作为模板蛋白质,制备了双模板蛋白质表面印迹的聚合物(Bi-MIP),考察了Bi-MIP制备过程中辅助功能单体的加入量对模板蛋白质BSA 和Lyz 印迹效果的影响,通过静态吸附实验,对Bi-MIP 吸附双模板蛋白质的吸附性能进行了研究。

  1 实验部分

  1. 1 仪器与试剂

  日本岛津高效液相色谱仪(HPLC)(LC-20A)。Lyz 和BSA(Amresco 公司);牛血清样品(广州鑫特生物制品有限公司);鸡蛋清样品由新鲜鸡蛋在冷冻离心机中以10 000 r / min 离心30 min 的上清液得到,冷冻保存备用。

  N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)(Acros Organics公司);丙烯酰胺(AAm)和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)(Sigma-Aldrich 公司);N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺(DMAPMA)(日本东京化成工业株式会社);N,N,N′,N′,N″-五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)(Alfa Aesar 公司);CuCl(氮气保护下在乙酸中进一步提纯,北京市精细化学品有限公司);三氟乙酸(化学纯,北京化工厂);乙腈(色谱纯,Fisher ChemAlert 公司);四氢呋喃和三乙胺(北京北化精细化学品有限公司);2-溴代异丁酰溴(北京偶合科技有限公司);以上试剂除有特别说明外均为分析纯,实验用水均为二次蒸馏水。

  1. 2 双模板蛋白质表面印迹聚合物的制备

  据文献,用水热法制备Fe3O4粒子,接着采用溶胶凝胶法对Fe3O4粒子包覆硅层,得到Fe3O4@ SiO2。将Fe3O4@ SiO2分散在四氢呋喃和三乙胺的混合溶液中,在冰浴中对该体系反复抽真空和充高纯氮气3 次,再逐滴加入2-溴代异丁酰溴,氮气保护下,室温震荡反应12 h。反应结束后,洗涤干燥产物,得到引发剂修饰的Fe3O4纳米粒子(Fe3O4@initiator)。

  采用ATRP 法,在Fe3O4@ initiator 表面得到辅助功能单体DMAPMA 加入量不同的Bi-MIP 和非印迹聚合物(NIP),模板蛋白质和单体的量见表1。图1 为ATRP 法制备Bi-MIP 的示意图。具体制备方法以Bi-MIP-2 为例:在100 mL 的三颈圆底烧瓶中加入0. 2 g Fe3O4@ initiator,将其分散在20mL 0. 01 mol / L 磷酸缓冲溶液(PBS,pH 7. 0)中,加入0. 40 g 单体NIPAAm,0. 01 g 单体AAm,10μL 辅助单体DMAPMA,0. 005 3 g 交联剂MBAA,0. 05 g 模板蛋白质BSA,0. 01 g 模板蛋白质Lyz 和30 μL PMDETA,在振荡器上预聚合12 h。然后,对该混合体系抽真空20 min,接着向瓶中充入高纯氮气20 min,该过程反复3 次后,将15 mg CuCl 快速转入烧瓶中,此时,CuCl / PMDETA 构成催化体系,在引发剂Fe3O4@ initiator 作用下引发ATRP 反应,氮气保护下,室温震荡反应12 h。反应结束后,磁性分离,收集产物,并用1 mol / L NaCl 和二次水反复洗涤。产物干燥后,即得到Bi-MIP。NIP 的制备除不加模板蛋白质之外,其余步骤同上。

  1. 3 双模板蛋白质表面印迹聚合物对蛋白质的吸附实验

  考察了制备过程中功能单体的量对双模板蛋白质表面印迹聚合物吸附单一模板蛋白质和两种混合模板蛋白质的影响。称取2. 0 mg 不同的印迹聚合物置于离心管中,用缓冲溶液(0. 01 mol / L,pH 7. 0PBS)平衡后,加入1 mL 蛋白质溶液(分别为0. 4mg / mL BSA 溶液、0. 2 mg / mL Lyz 溶液和含有0. 4mg / mL BSA 与0. 2 mg / mL Lyz 的混合溶液),25℃下振荡吸附12 h。磁性分离聚合物后,吸取上清液。用HPLC 测定吸附前后的蛋白质的浓度。测定双模板蛋白质表面印迹聚合物对每一种目标蛋白质的静态平衡吸附容量,称取2. 0 mg 印迹聚合物置于离心管中,用缓冲溶液平衡后,加入已知浓度的BSA 溶液和Lyz 溶液,25 ℃下振荡吸附12h。磁性分离聚合物后,吸取上清液。用HPLC 测定吸附前后的蛋白质的浓度。考察了双模板蛋白质表面印迹聚合物对实际样品中模板蛋白质BSA 和Lyz 的吸附性能。取5. 0mg 印迹聚合物置于离心管中,用缓冲溶液平衡后,加入1 mL 20 倍稀释的实际样品(1 ∶1(体积比)混合的牛血清与鸡蛋清样品),25 ℃下振荡吸附12h。磁性分离聚合物后,吸取上清液。用HPLC 测定吸附前后的蛋白质的浓度。

  1. 4 蛋白质浓度的测定

  所有蛋白质浓度均由HPLC 测定。色谱条件如下:C8 色谱柱(250 mm×4. 6 mm,5 μm,30 nm)(安捷伦科技有限公司);流动相A 为0. 1% (v / v)三氟乙酸的80% (v / v)乙腈水溶液,流动相B 为0. 1% (v / v)三氟乙酸水溶液;线性梯度洗脱:在20min 内流动相A 由37. 5% 升高到62. 5% ;紫外检测波长214 nm;流速1. 0 mL / min;进样体积10 μL;柱温35 ℃。

  1. 5 吸附容量的测定

  吸附容量(Q)由吸附前后溶液中蛋白质浓度的变化、溶液体积和聚合物质量计算得到。Q 定义为每单位质量聚合物的吸附容量(mg / g),由下式计算:Q= (C0-Cf)V /m (1)式中,C0为初始蛋白质的质量浓度(mg / mL),Cf为吸附之后的最终蛋白质的质量浓度(mg / mL),V是蛋白质溶液的体积(mL),m 是聚合物的质量(g)。

  2 结果与讨论

  本文主要考察双模板蛋白质表面印迹聚合物的吸附性能,对该印迹聚合物的分析表征将在其他工作中考察。

  2. 1 碱性单体浓度不同的印迹聚合物对模板蛋白质的吸附

  碱性单体DMAPMA 有助于酸性大的蛋白质BSA 的印迹。在pH 7. 0 的印迹聚合物的制备溶液中,功能单体NIPAAm 和AAm 通过氢键作用排列到模板蛋白质BSA 和Lyz 周围,此时碱性单体DMAPMA 与Lyz 均带正电荷,存在斥力,而带正电的碱性单体DMAPMA 通过静电引力都自组装到带负电荷的BSA 表面。之后,制备溶液发生原子转移自由基聚合反应得到双模板蛋白质印迹聚合物,该印迹聚合物经模板洗脱、干燥后,形成了与模板BSA 的形状、氢键和离子间相互作用互补的BSA 印迹孔穴及与模板Lyz 的形状和氢键作用互补的Lyz印迹孔穴。其中碱性单体DMAPMA 的量直接关系到能否同时印迹BSA 和Lyz,并影响制备得到的印迹聚合物对BSA 和Lyz 的选择性。

  2. 1. 1 对模板蛋白质BSA 的吸附

  碱性辅助单体DMAPMA 加入量不同时制备的双模板蛋白质表面印迹的聚合物对模板蛋白质BSA 的吸附容量图。当碱性单体的量从0 μL 增加到30 μL 时,Bi-MIP 对BSA 的吸附容量随着碱性单体加入量的增加而增加。印迹聚合物的制备过程中碱性单体的量越多,其与BSA 之间的静电作用越强,吸附容量越大。但由表2 可知,Bi-MIP 对BSA 的选择性(αs,BSA)随着碱性单体的量的增加先增大后减小。这是因为适量的碱性单体与模板蛋白质之间形成的稳定配合物,有利于印迹过程中模板蛋白质印迹孔穴的形成;当碱性单体量超过一定值时,形成的印迹聚合物与模板蛋白质之间表现为较强的静电吸附,掩盖了印迹聚合物对模板蛋白质之间的印迹作用,表现为印迹聚合物的选择性降低。因此,碱性单体DMAPMA 量为20 μL 时制备得到的Bi-MIP-3,对模板蛋白质BSA 有较好的吸附容量和选择性。

  2. 1. 2 对模板蛋白质Lyz 的吸附

  碱性单体DMAPMA 加入量不同时制备的双模板蛋白质表面印迹的聚合物对模板蛋白质Lyz 的吸附容量图。当碱性单体量从0 μL 增加到30 μL 时,Bi-MIP 对Lyz 的吸附容量随着碱性单体加入量的增加而减小。制备印迹聚合物过程中所用碱性单体量越多,其与Lyz 之间的静电斥力越强,吸附容量越小。由表2 可知,Bi-MIP 对Lyz 的选择性(αs,Lyz)随着碱性单体量的增加而减小。当碱性单体量达到30 μL 时,Bi-MIP-4 对Lyz 无印迹作用,可能因为高浓度的碱性单体使制备过程中与其带相同电性的模板蛋白质Lyz 难以接近载体,无法形成对Lyz 的印迹。

  2. 1. 3 对双模板蛋白质混合溶液中蛋白质的吸附

  碱性单体DMAPMA 的量分别为10 μL和20 μL 时制备的Bi-MIP-2 和Bi-MIP-3 对双模板蛋白质混合溶液中BSA 和Lyz 的吸附容量图。在碱性单体量较大时,Bi-MIP 对混合溶液中BSA 和Lyz 吸附容量的变化符合其对单一模板蛋白质BSA和Lyz 的吸附容量变化趋势,即对BSA 的吸附容量随单体量的增加而增加,对Lyz 的吸附容量随单体量的增加而减小。与2. 1. 1 和2. 1. 2 节的结果相比,Bi-MIP-2 和Bi-MIP-3 对混合溶液中BSA 和Lyz的吸附量均减小,且由表2 可知,其对BSA 和Lyz选择性因子均增加。结果表明,在双模板蛋白质的混合溶液中,两种蛋白质同时存在虽然对Bi-MIP 吸附每一种蛋白质有抑制作用,对BSA 和Lyz 的吸附容量降低,但是增强了Bi-MIP 中BSA 印迹孔穴和Lyz 印迹孔穴对各自目标蛋白质的选择性。

  基于以上结果可知,碱性辅助功能单体DMAPMA 为20 μL 时制备得到的Bi-MIP-3 对双模板蛋白质BSA 和Lyz 有较好的吸附容量与选择性。2. 2 Bi-MIP 对模板蛋白质BSA 和Lyz 的吸附等温线研究了Bi-MIP-3 对单一模板蛋白质溶液中模板蛋白质的吸附等温线。使用静态平衡吸附法,分别测定了Bi-MIP-3 和NIP-3 对BSA(质量浓度范围为0. 1 ~ 0. 4 mg / mL)和Lyz(质量浓度范围为0. 1~ 0. 4 mg / mL)的吸附结合量,用Langmuir 吸附方程评价分子印迹聚合物的结合特性,Langmuir 吸附方程如下:Ce / Q=Ce / Qmax+1 / (KQmax)(2)式中Q 和Qmax分别是聚合物对模板蛋白质的实验吸附容量(mg / g)和最大理论吸附容量(mg / g),Ce为吸附平衡后溶液中蛋白质的质量浓度(mg / mL),K 为聚合物对模板蛋白质吸附的Langmuir 吸附平衡常数(mL / mg)。以Ce / Q 对Ce分别作图得到Bi-MIP-3 和NIP-3 对模板蛋白质BSA 和Lyz 的吸附等温线,根据拟合直线的斜率和截距计算得到BSA 和Lyz分别在Bi-MIP-3 和NIP-3 上的吸附平衡常数(K)和最大吸附容量(Qmax)。由表3 可知,BSA 和Lyz在Bi-MIP-3 上的Qmax高于在NIP-3 上的Qmax。结果表明,以BSA 和Lyz 为模板制备的双模板蛋白质表面印迹聚合物具有特异性识别BSA 和Lyz 的识别位点,Bi-MIP-3 对模板蛋白质BSA 和Lyz 具有较高的亲和性。

  2. 3 Bi-MIP 用于分离实际样品中的模板蛋白质

  考察了Bi-MIP-3 在实际样品中对目标蛋白质的吸附能力。牛血清和鸡蛋清样品的混合溶液作为BSA 和Lyz 的混合蛋白源。峰1 和峰2分别是标准Lyz 和BSA 的色谱峰。20 倍稀释的1 ∶1(体积比)混合的牛血清和鸡蛋清样品的色谱图。当混合实际样品被Bi-MIP-3 吸附分离后,上清液中的Lyz(峰1)和BSA(峰2)的峰高明显降低,而未知蛋白质的色谱峰(峰3和峰4)没有明显的变化。以上结果表明,Bi-MIP-3对牛血清与鸡蛋清样品的混合溶液中的BSA 与Lyz有较好的识别选择性,并对共存的其他蛋白质不存在交叉选择性。

  3 结论

  本文对混合蛋白质模板印迹技术进行了初探。通过原子转移自由基聚合法,在适量碱性功能单体存在下制备了BSA 和Lyz 为双模板蛋白质的表面印迹聚合物。该双模板蛋白质表面印迹聚合物在单一蛋白质溶液、混合蛋白质溶液及实际样品中对模板蛋白质均呈现出较强的吸附能力和较好的印迹效果,有望应用于双/ 多目标蛋白质的分离与识别。同时,该印迹聚合物的制备也为以其他双/ 多目标蛋白质为模板的识别材料的研制开发提供了思路。

    作者: 来源:
    发布时间:2019-01-18 浏览:
  • 复合材料专业开设专业英语的必要性
  • 复合材料专业英语兼顾文理,将语言应用与专业知识紧密结合。专业英语作为基础英语的后续课程,其教学目的是通过专业英语的教学,使学生
  • 01-18 关注:190
  • 对材料力学教材进行适当改革
  • 教育部于2010 年启动的“卓越工程师教育培养计划”(简称“卓越计划”)旨在培养造就大量能为走新型工业化发展道路
  • 01-18 关注:187
  • NO对人类及环境带来严重的危害
  • 1 引言  天然气的主要成分是CH4, CH4是H/C比值最高的碳氢化合物(HC), 因此CH4相比其他HC 燃料在燃烧过程中有更少的CO2生成量,并且天
  • 01-18 关注:1002
  • 右手材料和左手材料的研究
  • 左手材料是一种人工微结构材料,其电场矢量、磁场矢量和波矢方向构成左手螺旋关系,由于其介电常数和磁导率同时为负,又称为双负材料。
  • 01-18 关注:368
  • 机械冲床如何正确操作
  • 冲床应该如何正确操作1.冲床工必须经过学习,掌握设备的结构、性能,熟悉操作规程并取得操作许可方可独立操作。2.正确使用设备上安全保
  • 01-18 关注:166
  • 热处理与金相知识解析
  • 奥氏体1.组织: 碳在γ铁中的固溶体
    2.特性:
    呈面心立方晶格.最高溶碳量为2.06%,在一般情况
    下,具有高的塑性,但强度和硬度低
  • 01-18 关注:292
  • 便携式吊运机机械上料重大突破
  • 便携式吊运机的问世是当今建筑装潢行业机械上料的重大突破,从此结束了千百年来高层建筑材料及装修材料依靠人工搬运的历史,极大地减轻
  • 01-18 关注:189
Baidu
map